В нашей работе была получена степень эффективности ингибитора (противовирусного препарата) методами ФОЕ (стандартный вирусологический метод) и флуоресцентной детекции. Обработка результатов ингибирования фокусов и интенсивности флуоресценции системой пробит- анализа позволяет находить необходимый параметр IC50, а также сравнивать различные методики для его нахождения.
На рисунке 19 представлены полученные IC50 для ингибитора фетуин методами ФОЕ и флуоресцентной детекции, которые не отличаются на уровне значимости 5%. Данные о степени эффективности ингибитора приведены ниже в таблице 3.
Также при решении обратной задачи метода флуоресцентной детекции были получены кинетические параметры системы «вирус- клетка», полученные для данного вируса Aichi и клеток линии MDCK методом ИФА. Данные о кинетических константах также приведены ниже в таблице 3.
Таблица 3 Кинетические параметры, полученные различными методами (*)
метод
T0C
k+, М-1·s-1
k-, М-1·s-1
kin, М-1·s-1
tнасыщ, min
IC50, М
ФОЕ
37
-
-
-
-
Флуоресц. детекции
37
(2,5±0,2)·108
(6,6±0,5)·10-4
(5±0,3)·10-3
2,6±0,4
ИФА
32
(1±0,1)·105
(3±0,4)·10-4
(2±0,2)·10-4
30±2
-
ИФА
10
(3,3±0,3)·104
(1±0,1)·10-4
0
-
-
(A/PR8/34)+ MDCK*
20
-
-
2,6·10-4
-
-
Полученные значения, приведенные в таблице 3 хорошо согласуются между собой: при увеличении температуры возрастают k+ и kin (за счет повышения пластичности мембраны клетки (можно сказать ее плавления), что приводит большей гибкости и в конечном итоге к более быстрому (за счет этого с ростом температуры уменьшается tнасыщ) и более крепкому взаимодействию нескольких рецепторов с одним вирионом).
k - остается практически неизменным.
kin возрастает резко: от отсутствия эндоцитоза при 100С до резкого увеличения на порядок при 370С (в сравнении с 320С).
Однако, существенные различия между параметрами, полученными данными методами можно объяснить тем, что во всех методиках, кроме флуоресцентной детекции (ФОЕ, ИФА, ) использовался клеточный монослой, тогда как в методе флуоресцентной детекции для насыщения системы клеточными рецепторами, использовалась клеточная суспензия, что объясняет самую быструю адсорбцию вируса на клетку.
Таблица 4 Сравнительная характеристика методов ФОЕ, ИФА и флуоресцентной детекции на основании полученных результатов
метод
IC50
in(t)
s(t)
k±
tнасыщ
kd(Vi+ing)
kd(Vi+cells)
Рабочее время
ФОЕ
+
-
-
-
-
-
-
~24ч.
ИФА
-
-
+
+
+
+
+
~1,5ч.
Фл. детекции
+
+
+
+
+
+
+
~30м. Перейти на страницу: 1 2